步骤
1. 固定。将标本置于95%或100%乙醇中浸泡一周以上,个体较大的标本需要浸泡更长时间。
2. 解剖。去除内脏和脂肪,不损伤骨骼的前提下尽量去除表皮和鳞片。
3. 软骨染色。将样本置于30%乙酸+70%乙醇+阿利新蓝染色中1天。染色结束时软骨应呈蓝色。
4. 复水。用大量水浸泡标本12-24小时,勤换水,将标本内酒精和醋酸彻底溶出。
5.预透明。将标本放入1% KOH溶液中浸泡至可见脊椎(十几分钟到几小时不等),可根据标本大小自行增减浓度,浸泡时间不要过长。
此步骤标本变为果冻状,注意观察,若标本肌肉甚至骨骼被溶解立刻降低KOH浓度。
6. 硬骨染色。配制茜素红乙醇饱和溶液 ,加入 9倍体积的 1% 氢氧化钾溶液 ,浸泡1-2天,直到硬骨染为紫红色。浸泡时间不要过长,以免后续软组织脱色困难。
此步骤要注意观察,防止标本被溶解。硬骨染色液配方不止一种,熟悉操作后可自行摸索效果合适的配比。
7.漂白。将样品置于3%过氧化氢溶液中浸泡数小时,注意不要让骨骼被漂白。若标本色素沉积较少,可跳过此步骤。
8. 梯度甘油透明。水:1%KOH溶液:甘油=5:3:2配置透明液,混匀后放入标本直至软组织变得透明,期间需要换液,浸泡时间几天至几个月(取决于大小和染色程度),直到完全去除软组织颜色。此时标本应骨骼颜色清晰,软组织几乎无色。用40%、60%、80% 和 100% 浓度的甘油梯度浸泡,最后转移至纯甘油中保存,加入少量百里香酚防腐。
注:保存不当的标本软骨上色不佳,若只染硬骨(红色)可跳过步骤3。
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