新型表观遗传编辑器CRISPRoff：实现持久可遗传且可逆的转录调控
BioArt生物艺术
发布时间: 04-1017:12
撰文 | 木兰之枻
责编 | 兮
CRISPR相关的基因编辑技术让生物医学研究步入了新时代。除直接改变基因组DNA序列外，CRISPR系统还被深度改造后应用于转录调控、表观遗传学修饰、RNA编辑和核酸检测等多个研究领域。在表观遗传修饰和转录调控研究领域，研究者开发出CRISPRa/CRISPRi等多种工具用于高通量筛选和疾病治疗并取得众多成果（详见BioArt报道：Cell丨精确制导，安全提升，基于靶向表观遗传治疗的新一代CRISPR/Cas9技术—附专家点评 ）【1】。不过现有的工具仍多有不足：其对基因转录的调控效果缺乏持久性和可遗传性；而表观遗传修饰的编辑效果和普适性仍然有待改进。
2021年4月9日，来自美国加州大学旧金山分校（UCSF）的Jonathan S. Weissman实验室与Luke A. Gilbert实验室合作在Cell发表题为Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing的论文。文章以CRISPR系统为基础，开发出一套新的表观遗传编辑器CRISPRoff，其瞬时表达便可实现持久可遗传且可逆的DNA甲基化修饰和基因转录调控。研究还指出，CRISPRoff对DNA甲基化修饰和基因转录的调控并不依赖于经典的启动子CpG岛结构，因此对绝大多数基因的转录都有调控作用。基因表达调控的持久性和普适性让CRISPRoff系统在生物医学研究中的应用前景值得期待。
现有的转录调控/表观遗传编辑工具如CRISPRi（dCas9-KRAB）及dCas9-Dnmt3a（D3A）-Dnmt3L（D3L）的转录抑制效果缺乏持久性和可遗传性【2】。如今研究者将KRAB和D3A-D3L分别融合于dCas9的N-/C-末端，构建出新的表观遗传编辑器CRISPRoff-V1和CRISPRoff-V2（图1），并在GFP报告细胞系中检测其效果。结果显示，CRISPRoff特别是CRISPRoff-V2能持久抑制GFP报告基因的表达：CRISPRoff-V2短时表达对基因转录的抑制效果至少可持续50天。研究还指出，CRISPRoff-V2可在包括iPSCs、HeLa、U2OS、K562在内的多种细胞系中持久抑制内源基因的表达，并能实现多个基因的组合表达调控。单细胞克隆实验还证实，CRISPRoff-V2对内源基因的抑制效果至少可持续15个月，或持续~450次细胞周期。随后，研究者通过转录组测序、全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）以及ChIP-seq实验证实，CRISPRoff对表观遗传修饰和基因转录的调控具有很高的特异性。
图1 CRISPRoff结构（A）及转录调控效果检测示意图（B）。
CRISPRoff主要是通过促进靶位点附近的DNA甲基化实现持久可遗传的基因转录抑制。为验证转录抑制的可逆性，研究者将DNA去甲基化酶TET1与dCas9融合，并结合MS2-MCP系统，设计出可介导靶位点DNA去甲基化和基因转录激活的新工具CRISPRon。后续研究指出，CRISPRon可有效逆转CRISPRoff介导的DNA甲基化修饰和转录抑制。
CRISPRoff用于全基因组筛选的可行性和效果如何？研究者利用双sgRNA文库和混合式筛选检验CRISPRoff在细胞生长的关键调控基因筛选中的效果。结果显示，可持久抑制基因表达的CRISPRoff系统在全基因组筛选中的效果明显优于只能短时抑制基因表达的CRISPRoff突变体，表明CRISPRoff系统在全基因组筛选中有广阔的应用前景。
经典模型认为，启动子区域CpG岛结构的存在是DNA甲基化修饰发生和基因转录抑制的前提，但约30%的人类基因启动子区域并无典型的CpG岛存在【3】。CRISPRoff对CpG岛缺乏型基因的转录是否有抑制效果？研究者首先对上文的高通量筛选数据进行重分析，结果显示CRISPRoff依然能通过促进DNA甲基化修饰有效抑制CpG岛缺乏型基因的转录。后续的验证实验也证实，CRISPRoff的确能通过促进DNA甲基化修饰而持久抑制大多数CpG岛缺乏型基因的转录。
前期研究指出，CRISPRi要有效的抑制基因转录，其活性sgRNA的靶位点局限于转录起始位点下游非常有限的核小体缺失区域【4】。CRISPRoff的活性sgRNA是否有类似的特性？研究者设计出覆盖数百种基因转录起始位点上下游1kb的sgRNA文库，并用于分析CRISPRoff的活性sgRNA特性。结果显示，CRISPRoff的活性sgRNA广泛分布于转录起始位点两侧500bp的窗口区域，且主要位于核小体缺失区域。进一步的机制研究指出，CRISPRoff对基因转录的持久抑制依赖于sgRNA靶位点附近组蛋白H3K9me3修饰和DNA甲基化修饰的形成。
研究者还发现，iPSCs中CRISPRoff对基因转录的抑制效果并不受细胞分化的影响：iPSCs中MAPT基因（tau蛋白编码基因）位点因H3K27me3修饰的存在而处于转录抑制状态，当iPSCs分化为神经元后，MAPT基因表达明显增加。但iPSCs中利用CRISPRoff抑制MAPT基因转录后再诱导神经元分化，仍有30%的神经元中tau蛋白的表达明显减少。最后，研究者还指出，CRISPRoff还能作用于增强子区域调控基因转录，在增强子功能研究中极具应用前景。
本研究开发的表观遗传编辑新工具CRISPRoff具有以下特点：可实现持久可遗传的转录抑制效果；转录抑制具有可逆性；转录抑制对绝大多数基因有效，具有普适性；转录抑制具有高特异性。机制研究表明，CRISPRoff是通过促进DNA甲基化和组蛋白H3K9me3修饰而抑制基因转录，但并不依赖于经典的CpG岛结构。综上可知，CRISPRoff介导的表观遗传修饰和转录抑制在生物医学研究中极具潜力，其在全基因组筛选、细胞工程、增强子沉默以及表观遗传修饰的遗传机制研究中的应用前景值得期待。
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发布时间: 04-1017:12
撰文 | 木兰之枻
责编 | 兮
CRISPR相关的基因编辑技术让生物医学研究步入了新时代。除直接改变基因组DNA序列外，CRISPR系统还被深度改造后应用于转录调控、表观遗传学修饰、RNA编辑和核酸检测等多个研究领域。在表观遗传修饰和转录调控研究领域，研究者开发出CRISPRa/CRISPRi等多种工具用于高通量筛选和疾病治疗并取得众多成果（详见BioArt报道：Cell丨精确制导，安全提升，基于靶向表观遗传治疗的新一代CRISPR/Cas9技术—附专家点评 ）【1】。不过现有的工具仍多有不足：其对基因转录的调控效果缺乏持久性和可遗传性；而表观遗传修饰的编辑效果和普适性仍然有待改进。
2021年4月9日，来自美国加州大学旧金山分校（UCSF）的Jonathan S. Weissman实验室与Luke A. Gilbert实验室合作在Cell发表题为Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing的论文。文章以CRISPR系统为基础，开发出一套新的表观遗传编辑器CRISPRoff，其瞬时表达便可实现持久可遗传且可逆的DNA甲基化修饰和基因转录调控。研究还指出，CRISPRoff对DNA甲基化修饰和基因转录的调控并不依赖于经典的启动子CpG岛结构，因此对绝大多数基因的转录都有调控作用。基因表达调控的持久性和普适性让CRISPRoff系统在生物医学研究中的应用前景值得期待。
现有的转录调控/表观遗传编辑工具如CRISPRi（dCas9-KRAB）及dCas9-Dnmt3a（D3A）-Dnmt3L（D3L）的转录抑制效果缺乏持久性和可遗传性【2】。如今研究者将KRAB和D3A-D3L分别融合于dCas9的N-/C-末端，构建出新的表观遗传编辑器CRISPRoff-V1和CRISPRoff-V2（图1），并在GFP报告细胞系中检测其效果。结果显示，CRISPRoff特别是CRISPRoff-V2能持久抑制GFP报告基因的表达：CRISPRoff-V2短时表达对基因转录的抑制效果至少可持续50天。研究还指出，CRISPRoff-V2可在包括iPSCs、HeLa、U2OS、K562在内的多种细胞系中持久抑制内源基因的表达，并能实现多个基因的组合表达调控。单细胞克隆实验还证实，CRISPRoff-V2对内源基因的抑制效果至少可持续15个月，或持续~450次细胞周期。随后，研究者通过转录组测序、全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）以及ChIP-seq实验证实，CRISPRoff对表观遗传修饰和基因转录的调控具有很高的特异性。
图1 CRISPRoff结构（A）及转录调控效果检测示意图（B）。CRISPRoff主要是通过促进靶位点附近的DNA甲基化实现持久可遗传的基因转录抑制。为验证转录抑制的可逆性，研究者将DNA去甲基化酶TET1与dCas9融合，并结合MS2-MCP系统，设计出可介导靶位点DNA去甲基化和基因转录激活的新工具CRISPRon。后续研究指出，CRISPRon可有效逆转CRISPRoff介导的DNA甲基化修饰和转录抑制。
CRISPRoff用于全基因组筛选的可行性和效果如何？研究者利用双sgRNA文库和混合式筛选检验CRISPRoff在细胞生长的关键调控基因筛选中的效果。结果显示，可持久抑制基因表达的CRISPRoff系统在全基因组筛选中的效果明显优于只能短时抑制基因表达的CRISPRoff突变体，表明CRISPRoff系统在全基因组筛选中有广阔的应用前景。
经典模型认为，启动子区域CpG岛结构的存在是DNA甲基化修饰发生和基因转录抑制的前提，但约30%的人类基因启动子区域并无典型的CpG岛存在【3】。CRISPRoff对CpG岛缺乏型基因的转录是否有抑制效果？研究者首先对上文的高通量筛选数据进行重分析，结果显示CRISPRoff依然能通过促进DNA甲基化修饰有效抑制CpG岛缺乏型基因的转录。后续的验证实验也证实，CRISPRoff的确能通过促进DNA甲基化修饰而持久抑制大多数CpG岛缺乏型基因的转录。
前期研究指出，CRISPRi要有效的抑制基因转录，其活性sgRNA的靶位点局限于转录起始位点下游非常有限的核小体缺失区域【4】。CRISPRoff的活性sgRNA是否有类似的特性？研究者设计出覆盖数百种基因转录起始位点上下游1kb的sgRNA文库，并用于分析CRISPRoff的活性sgRNA特性。结果显示，CRISPRoff的活性sgRNA广泛分布于转录起始位点两侧500bp的窗口区域，且主要位于核小体缺失区域。进一步的机制研究指出，CRISPRoff对基因转录的持久抑制依赖于sgRNA靶位点附近组蛋白H3K9me3修饰和DNA甲基化修饰的形成。
研究者还发现，iPSCs中CRISPRoff对基因转录的抑制效果并不受细胞分化的影响：iPSCs中MAPT基因（tau蛋白编码基因）位点因H3K27me3修饰的存在而处于转录抑制状态，当iPSCs分化为神经元后，MAPT基因表达明显增加。但iPSCs中利用CRISPRoff抑制MAPT基因转录后再诱导神经元分化，仍有30%的神经元中tau蛋白的表达明显减少。最后，研究者还指出，CRISPRoff还能作用于增强子区域调控基因转录，在增强子功能研究中极具应用前景。
本研究开发的表观遗传编辑新工具CRISPRoff具有以下特点：可实现持久可遗传的转录抑制效果；转录抑制具有可逆性；转录抑制对绝大多数基因有效，具有普适性；转录抑制具有高特异性。机制研究表明，CRISPRoff是通过促进DNA甲基化和组蛋白H3K9me3修饰而抑制基因转录，但并不依赖于经典的CpG岛结构。综上可知，CRISPRoff介导的表观遗传修饰和转录抑制在生物医学研究中极具潜力，其在全基因组筛选、细胞工程、增强子沉默以及表观遗传修饰的遗传机制研究中的应用前景值得期待。
