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关于PCR和琼脂糖凝胶电泳~求教,555,刚被老外教训了,求安慰啊...

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再这样下去,俺这活真干不下去了...深刻意识到学校的实验和实际生产有多大区别。
俺做的东西其实不难,就是提取个DNA,然后做下PCR,再跑下胶,几乎不用动脑子。
但是现在又个严重的问题是,撇开DNA提取不说。每次新的试剂盒到时都要做个验证实验,
就是用纯DNA稀释液,做个梯度实验,一个浓度的稀释液点2管,并列的。但是跑完胶以后
两管显示的信号就是不一样,总是有强弱。明明是同一管稀释液的样品啊。我们老板分
析结果是我移液枪操作不对,说我点样有多少。作为一个大学用了几年移液枪的人来说
真是很伤自尊。但是忍了,谁叫我做不好呢,可能真的是我有什么操作坏习惯也不一定,
于是我去查了移液枪使用方法,可来来回回看好几遍也没发现自己有啥错误。大家帮我想想可能是什么问题.
移液枪才用1年,应该没什么问题,也没松。PCR仪也才用一年,找人来检查过,测过也没什么温度漂移的问题。
我们老板每次都问我问题,我都回答不出来,比如“移液枪吸液时按到第一止点,你怎么肯定是到了第一止点呢”?我要怎么回答,难道说是手感吗。
或者说有没有办法测定移液枪操作出了问题,要怎么改正?



IP属地:浙江1楼2010-07-28 22:08回复
    我们这实验室是老外提供技术试剂的。但是实际面对面培训只有3,4次,其他都是邮件交流,MD,本来就英语水平有限,再搭上点事就更说不清楚了。刚看到邮件,说我们做了一年多了,却越来越退步了,说我们像个初学者,说我们光说不练...严重打击中....


    IP属地:浙江2楼2010-07-28 22:13
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      求教下,这个上面飘着像云像烟的是什么?我用的EB量是20μl/25ml,溴酚蓝是每PCR管12μl,胶浓度是1.5%左右,跑的DNA大小约150-180bp。跑胶的时候溴酚蓝会有飘出来但是我都吹散的,以前一直是好好的。


      IP属地:浙江3楼2010-07-28 22:24
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        这就是我做的梯度验证,2-3,4-5,6-7,8-9,都两管同一浓度,从同一管稀释液中取的样,可是结果却有强弱,而且还总是第1管弱...难道真是操作问题,...俺已经很认真了...555


        IP属地:浙江4楼2010-07-28 22:33
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          第一停点有个很明显的卡嗒一下(不是声音指手感)


          5楼2010-07-28 22:50
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            这个时候考验你的意志力


            6楼2010-07-28 22:52
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              安慰一个~


              7楼2010-07-28 22:53
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                ....LS亲,抱住蹭蹭......真的是已经自信全无了...不知道怎么办好,我明天打算用天平来测下移液枪操作有没有问题,以前也做过一次,取同体积的样,每次重量都差不多啊,怎么就操作不行了呢...


                IP属地:浙江8楼2010-07-28 23:05
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                  枪头有问题?
                  枪头与枪结合不紧会漏点气。


                  IP属地:云南9楼2010-07-29 00:33
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                    • 61.134.11.*
                    是不是点样孔点得太满了?
                    老外一般不至于脾气这么大
                    另外,您用什么采的图?怎么是红的?
                    紫外灯下原色成像吗?
                    话说好亮啊,一般不需要这么亮,这么亮容易掩盖差距
                    EB是不是后加的?要不你换成配到胶里试试?


                    10楼2010-07-29 08:45
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                      弱弱问一下你的稀释梯度验证是直接把dna溶液去跑胶还是用这些dna溶液做模板去pcr,然后pcr产物跑胶?
                      如果是dna溶液直接跑胶,第二管比第一管信号弱很容易理解,因为图上显示第二管总比第一管有更多的降解,且越后面的稀释度的降解现象越厉害。但不知道为什么会有这样的降解现象出现,我工作环境是如何?操作的时候是否注意dnase的污染?你自己看看吧。
                      别从用枪用仪器上去找原因了,说难听点,移液器吸了多少液体我想你眼睛看一眼就知道了,准不准一目了然。这点要相信自己。
                      如果是pcr产物跑电泳,我想问一下你是不是热启动pcr,taq在室温下也还是有活性,会产生一些片段,可能你pcr体系配置的这段时间差就造成了你产物量的多少差异。
                      以上仅仅是我的推测


                      11楼2010-07-29 10:00
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                        回复:10楼,11楼
                        这图片是直接紫外灯上拍的,还没处理成黑白图。不知道为什么,同一个位置固定高度拍的图经常不一样,可能跟光线有关。有时曝光时间也影响照片亮度,我也不懂要怎么去调。
                        EB我是配胶的时候加的,可能有点多,所以比较红。至于在胶上点样,我每孔点12μl样品,也不算太多。
                        稀释梯度验证时DNA溶液是做为模板跑完PCR再去做胶的。浓度梯度是:1:10W,1:50W,1:100W,1:500W,所以正常应该是信号依次减弱。
                        跑PCR前,我都预热PCR仪的(105℃)。
                        配置PCR体系,我是全配完分装到PCR管内,然后再每管加入1.5μl的DNA溶液做模板,并列
                        两管之间时间差应该不超过20秒。


                        IP属地:浙江12楼2010-07-29 13:50
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                          正在上高中的看到这些感到很有压力


                          13楼2010-07-29 14:00
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                            • 61.134.11.*
                            “跑PCR前,我都预热PCR仪的(105℃)。”
                            您误解了11楼的话“你是不是热启动pcr,taq在室温下也还是有活性,会产生一些片段”
                            他这里指的不是PCR仪,而是你在配体系的时候有没有把所有的管子以及试剂都放在冰上操作
                            如果放在室温,在放进PCR仪之前,管子里会有非特异的反应
                            另外,我点样只点5ul,不过这个得取决于孔的大小,如果你的孔大,多加一点好,因为量越小,误差越大
                            另一影响因素就是亮度,如果太亮,不妨少加,或者稀释了再加,可以使差距明显
                            不过后面这几条不会是影响你实验结果的主要原因


                            14楼2010-07-29 17:40
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                              • 113.65.169.*
                              楼主,老外提供的东西已确定没问题吗?


                              15楼2010-07-29 17:47
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