抗生素研发的第三阶段是确定生物靶点和作用机制。在这一阶段，研究人员将研究和分析抗生素前体中的化学物质以及抗生素有效成分的结构-功能关系，确定可能的抗生素作用靶点，即抗生素作用的分子机制。一旦确定了抗生素作用的分子靶点，就可以开发出能够有效降低细菌抗性的新型抗生素类药物。