1. 蛋白类型
确定你的蛋白是什么类型，蛋白类型决定你要使用的表达系统。
胞质蛋白——大肠杆菌系统
分泌蛋白——酵母表达系统（因为大肠杆菌系统缺乏翻译后修饰功能)
膜蛋白——杆状病毒或酵母表达系统
2. 酶切位点
分析目的蛋白DNA序列的酶切位点，使用T4连接酶的方式构建载体时，不要使用目的蛋白DNA序列包含的酶切位点，以防将目的蛋白的DNA序列切断。
3. 稀有密码子
定义：遗传密码子有64种，但是绝大多数生物使用密码子具有偏好性，倾向于利用这些密码子中的一部分。那些不被经常利用的称为稀有密码子。
稀有密码子是影响重组表达水平的一个重要因素，过多的稀有密码子会使蛋白难以表达或表达错误。
解决方法：
1. 分析目的蛋白DNA序列包含的稀有密码子。
2. 查看稀有密码子分布及数量。
一般连续3个以上稀有密码子的区域会影响蛋白表达。
3. 改造序列。
将稀有密码子改为常用密码子。
4. 使用rosetta系列菌株。
Rosetta系列菌株来源于BL21系列宿主菌,该系列菌株包含多种稀有密码子(AUA,AGG,AGA, CUA,CCC, GGA) 。
4. GC含量
GC含量过高 (大于70%) 会造成RNA二级结构稳定性增加，减慢或暂停翻译
GC含量过低 (小于30%) 则会减慢转录延伸，不利于蛋白的表达。
解决方法：
1. 使用SnapGene查看目的蛋白DNA序列的GC含量。
2. 改造序列，可通过基因合成。
5. 蛋白分子量大小
一般小于10kD或者大于100kD蛋白都是难于表达。
解决方法：
蛋白较小：
1. 采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。
2. 加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的蛋白标签。
蛋白较大：
1. 使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。
2. 截取重要部分表达。首先要根据目的进行截取，如果是为了抗体制备，就要截取抗原性较强的部分片段。
6. 二级结构
目的蛋白mRNA如果形成大而稳定的二级结构（特别是在特别是起始密码子附近），例如发卡结构和茎环结构等，会影响mRNA在翻译过程中核糖体的结合和延伸，从而降低翻译的效率和最终的蛋白表达水平。
解决方法：
1. 分析目的蛋白的二级结构
2. 通过序列改造优化密码子，保证启动子区和起始密码子不在二级结构内。
确定你的蛋白是什么类型，蛋白类型决定你要使用的表达系统。
胞质蛋白——大肠杆菌系统
分泌蛋白——酵母表达系统（因为大肠杆菌系统缺乏翻译后修饰功能)
膜蛋白——杆状病毒或酵母表达系统
2. 酶切位点
分析目的蛋白DNA序列的酶切位点，使用T4连接酶的方式构建载体时，不要使用目的蛋白DNA序列包含的酶切位点，以防将目的蛋白的DNA序列切断。
3. 稀有密码子
定义：遗传密码子有64种，但是绝大多数生物使用密码子具有偏好性，倾向于利用这些密码子中的一部分。那些不被经常利用的称为稀有密码子。
稀有密码子是影响重组表达水平的一个重要因素，过多的稀有密码子会使蛋白难以表达或表达错误。
解决方法：
1. 分析目的蛋白DNA序列包含的稀有密码子。
2. 查看稀有密码子分布及数量。
一般连续3个以上稀有密码子的区域会影响蛋白表达。
3. 改造序列。
将稀有密码子改为常用密码子。
4. 使用rosetta系列菌株。
Rosetta系列菌株来源于BL21系列宿主菌,该系列菌株包含多种稀有密码子(AUA,AGG,AGA, CUA,CCC, GGA) 。
4. GC含量
GC含量过高 (大于70%) 会造成RNA二级结构稳定性增加，减慢或暂停翻译
GC含量过低 (小于30%) 则会减慢转录延伸，不利于蛋白的表达。
解决方法：
1. 使用SnapGene查看目的蛋白DNA序列的GC含量。
2. 改造序列，可通过基因合成。
5. 蛋白分子量大小
一般小于10kD或者大于100kD蛋白都是难于表达。
解决方法：
蛋白较小：
1. 采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。
2. 加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的蛋白标签。
蛋白较大：
1. 使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。
2. 截取重要部分表达。首先要根据目的进行截取，如果是为了抗体制备，就要截取抗原性较强的部分片段。
6. 二级结构
目的蛋白mRNA如果形成大而稳定的二级结构（特别是在特别是起始密码子附近），例如发卡结构和茎环结构等，会影响mRNA在翻译过程中核糖体的结合和延伸，从而降低翻译的效率和最终的蛋白表达水平。
解决方法：
1. 分析目的蛋白的二级结构
2. 通过序列改造优化密码子，保证启动子区和起始密码子不在二级结构内。
