AR综述 运行中的进化论：植物的除草剂抗性

Title: Evolutionin Action: Plants Resistant to Herbicides
虽然年代稍久，但仍然是除草剂抗性研究中经典的综述代表

在过去40年里，现代除草剂防治很大程度上取代了人工、动物和物理防治，在提升农作效率的同时，又没有导致杂草的灭绝，就像杀虫剂没有完全清楚害虫，抗生素没有彻底消灭病原物一样。对于靶标植物而言，除草剂是一种快速、极端的胁迫活动。但通常有些罕见的个体具有抗性基因，能使其存活繁衍。持续不间断地施用除草剂，会促使抗性问题产生。
除草剂抗性产生有如下一些因素影响：
基因层面：抗性基因频率、抗性基因数量、抗性基因优势、抗性基因适合度；
生物层面：交叉授粉与否、种子繁殖能力、种子在土壤种子库里的生命力、种子和花粉的移动能力；
除草剂层面：化学结构、作用位点、残留活性；
操作层面：除草剂剂量、操作技术、农业-生态系统因素；
其发挥作用主要有如下流程：有特殊的化学性质→进入植株体内→输导→以致死剂量到达作用部位；
而抗性类型主要有如下两类：
靶标抗性TSR：除草剂以致死剂量到达作用靶标，但靶标结构有所改变以限制除草剂发挥作用；
非靶标抗性NTSR：使到达作用位点的除草剂量最小化。

除草剂靶标抗性
靶标抗性主要有如下两种类型：
1、基因突变：在靶标酶处氨基酸改变
2、靶标酶过表达（基因扩增或者启动子结构改变）
PSII-抑制剂 三嗪类除草剂：一个psbA基因突变体在全球独自发展
PSII抑制剂包含三嗪类、三嗪酮类、脲类、尿嘧啶类和双氨基甲酸酯类除草剂
作用机制：与光合电子传递链中的质体醌PQ竞争PSII复合体中D1蛋白上的PQ结合位点，导致NADPH、ATP生成及碳循环受限，进一步产生碳水化合物胁迫和氧化胁迫。
目前其抗性主要由点突变产生，由母系遗传的叶绿体psbA基因编码D1蛋白发生点突变，导致264位的丝氨酸突变为甘氨酸(Ser-264-Gly)。几乎所有进化出三嗪类除草剂抗性的杂草种类都含有该突变。264位的Ser提供了一个氢键，对PQ和三嗪类除草剂结合具有重要意义。Gly替换使得该氢键受移除，进而阻碍了三嗪类除草剂的结合，但同时也导致了光合效能下降。
其它抗性方面，Ser-264-Gly虽然阻碍了三嗪类除草剂的结合，但没有限制其它非三嗪类的PSII抑制剂。而Ser-264-Thr突变则可同时抑制三嗪类和脲类除草剂作用，机制为阻碍其与PQ结合位点竞争，并且限制了与Phe-225的相互作用。这些突变也带来了不同程度的适合度代价。
图分别为光合电子传递链(From Taiz)、PSII反应中心结构（From Zouni et al）、三嗪类除草剂作用机制(Stephen B. Powlews)

乙酰辅酶A羧化酶ACCase抑制剂类除草剂：8个抗性突变型
乙酰辅酶A羧化酶有两种类型，分别为异质型（原核）和同质型（真核）。在植物体内，异质型一般位于质体，同质型位于胞质溶胶。而禾本科Grasses植物，无论是胞质溶胶还是质体内的ACCase，都属于真核型。
乙酰辅酶A羧化酶ACCase催化脂肪合成反应：
乙酰CoA + ATP +HCO3→ACCase催化→丙二酸单酰CoA + ADP +Pi
对应抑制剂代表有：芳氧苯氧基丙酸酯类、环己二酮、苯基吡唑啉类、
其中，在羧酸转移CT结构域出现的Leu-1781-Ile突变赋予叶绿体内ACCase产生抗性。
在互作方面，前沿研究基于酵母ACCase的结构域晶体结构发现催化位点在二聚体的界面缝隙处。ACCase抑制剂类除草剂结合在结构域位置，且部分叠合于催化位点。但具体的结合细节还处于未知阶段，只能猜测氨基酸替换发生于催化缝隙，改变了凹穴的形状。
在研究突变的适合度代价方面，目前通过精细基因型区分，分离获得F2家族的纯合子和杂合子。以此作为研究方法，发现Ile-1781-Leu突变引起适合度优势，而Asp-2078-Gly、Cys-2088-Arg则产生适合度代价，Ile-2041-Asn则呈中性。
图为芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂主要类型

草甘膦Glyphosate：EPSPS 106位氨基酸Pro突变体
EPSPS是烯醇式丙酮酸莽草酸磷酸合成酶，催化莽草酸-3-磷酸（S3P）+ 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）合成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸，是芳香性氨基酸的合成核心步骤。
第一例抗性发现于牛筋草Eleusina indica植株上106位Pro脯氨酸被Ser丝氨酸替换，该突变位于一个高度保守的区域。授予了中等水平的草甘膦抗性。
通过对大肠杆菌表达的EPSPS蛋白晶体结构和分子模型分析可以发现，草甘膦通过占领PEP的结合位点进而抑制EPSPS活性。而上述取代则使得上述结合位点略微缩窄。
另外，EPSPS基因过表达或者放大也会导致草甘膦抗性产生。在长芒苋
Amaranthus palmeri的一个生物型发现高达100倍的EPSPS基因扩增（基因拷贝数量增加），导致高达40倍的EPSPS过表达。该抗性由实验室筛选草甘膦抗性细胞系获得。在硬直黑麦草的一个生物型中，也发现有EPSPS mRNA和酶活性水平存在3倍的增长，并不是由于基因扩增。
图为牛筋草

原卟啉原IX氧化酶PPO抑制剂型除草剂：新颖的删除型突变体
原卟啉原protoporphyrinogen（Protogen）→PPO→原卟啉protoporphyrinIX
植物体内有两种核编码的PPO同等型，分别是：1、叶绿体chloroplast内的PPO1，由PPX1编码；2、线粒体内的PPO2，由PPX2编码。
对应的除草剂种类包含二苯醚类（Diphenylethers）和（Oxidiazoles）
目前发现的抗性机制非常特殊，3-bp密码子的缺失导致1个氨基酸Gly（210）被删除，这是仅有的机制，但却是高抗。研究路线为：检测到Gly-210删除→对烟草Nicotiana tabacum突变株进行PPO2晶体结构分析，进而导致底物（卟啉原）结合结构域结构重排。
图为叶绿素合成通路

Cytochrome P450（细胞色素P450）以及进化除草剂抗性
害虫可以通过提升P450代谢能力可以对杀虫剂进行解毒，这是其主要进化的抗性机制。该领域解析得已经非常全面。但对比来看，杂草领域的P450s赋予抗药性相关研究则显得缺乏。P450s是最大的超家族酶系之一，在几乎所有物种体内都有发现。目前已有很多重要的P450s酶系被综述。植物P450s通常结合在内质网上，少数在质体膜上，对植物激素、甾醇、脂肪酸合成等次生代谢方面发挥着重要的作用。其主要发生羟基化（Hydroxylation）和去烷基化（Dealkylation）反应。P450s通过从NADPH中获得电子，从分子氧中激活或者插入一个原子以组成一个更活泼的化合物，该反应由NADPH-P450还原酶催化。因此一些P450s可以代谢特定的的除草剂来还原或者缓和其植物毒性，并进一步使除草剂失活。代谢通常是通过与葡萄糖螯合，并转入液泡储存。这在小麦和玉米中很常见，它们可以基于上述机制耐受多种作用类型的除草剂。
杂草可以基于P450s氧化机制，有效地代谢掉不同作用机制的除草剂，包括从未使用过的除草剂。目前已经发现有9种杂草生物型存在这种抗性。在这些研究中，可以通过P450抑制剂来部分或者全部逆转抗性效果。实验也通过低剂量除草剂处理来筛选获得抗性株，通过3代重复筛选就可以获得高水平抗性株。尽管这些研究暗示着P450是赋予抗性的重要源头，但是这还需要进一步的研究来证明。
P450蛋白可以共享低至16%的氨基酸一致性，目前有着超过2000个P450序列登记在P450数据库。 (http://drnelson.utmen.edu/cytochromep450.html) 但目前来看，大部分P450进化产生除草剂抗性事例都报道在禾本科杂草上，很少有双子叶植物的相关报道。虽然禾本科植物包含更多的P450基因抗性，但这也部分反映了很多研究只着重关注于靶标抗性。这里需要强调，基于P450的抗性是颇具警示性和威胁性的，因其能针对多种类型除草剂产生抗性，并且拓展至新发现的且可被代谢的除草剂。
图为玉米基因组中P450基因的检索结果

谷胱甘肽-S-转移酶和进化的除草剂抗性
谷胱甘肽-S-转移酶GSTs是一个多功能酶家族，催化一系列亲电子、疏水的底物螯合反应。在植物抗氧化胁迫方面具有重要作用，可以与活性氧相互作用。谷胱甘肽螯合的除草剂可以在液泡隔离，或者通过根部排出体外。
NCBI玉米基因组检索GST基因

抑制转导产生的除草剂抗性
像AHAS类这样的除草剂，目前已发现有22个靶点突变加上P450代谢抗性。然而像百草枯和草甘膦这种除草剂，其化学结构和作用模式决定其不能被植物完全代谢掉，草甘膦的靶标能突变的位点很少且有限，百草枯甚至没有靶标。因此，这些除草剂需要进化出另一些方式存活下来，包括限制除草剂在植株体内的转移。
以草甘膦为例，在进入叶片后，大部分药物通过木质部和韧皮部输导转移（通常跟随光合同化物进行源库运输），这对草甘膦发挥药物毒性具有重要意义。但后续，在黑麦草属发现第一例限制输导产生的抗性。这类抗性目前已在黑麦草属和假蓬属被广泛发现。实际上，输导抑制抗性和EPSPS Pro-106突变一样普遍。重要的是，目前已发现有很多黑麦草属的杂草兼具这两种抗性，而这也一定会蔓延至其它物种。其中潜在的生化机制仍有待确定，我们猜测其中可能是膜转运体将草甘膦泵出液泡所致。目前所知的是，这种机制是由一个单一的、核遗传、半显性基因引起的。还有证据表明在一些黑麦草属抗性生物型体内有限制草甘膦渗透的效果。此外在黑麦草的一些生物型体内还发现减少草甘膦叶渗透的现象。
限制转移赋予百草枯抗性
百草枯是一种触杀型农药，已在全球使用已超过40年。它可以快速渗透进叶片和叶绿体，干扰光系统I（PSI）进行电子传递，进而将氧还原为活性氧。对应抗性机制主要为增强活性氧解毒酶，也有研究发现在适宜温度下，抗性植株可以限制百草枯传导。限制传导作为核遗传半显性基因在几个物种内被发现。尽管限制传导是主要抗性机制，但当时我们仍然不清楚机制以及百草枯的阻隔位置。后续才有提出假设：借助液泡膜上的转导体，百草枯被阻隔在液泡内。这也在未来有望通过生化/基因层面解析。