有没有大神帮忙看一下这个是不是污染了#细胞污染##支原体污染#

如何选择最合适的抗体稀释液，以确保我们的WB实验结果既清晰又准确？我们可以分析几种具体的抗体稀释液，以及它们如何帮助解决抗体稀释的问题：1 通用型抗体稀释液：这种稀释液适用于多种免疫检测实验（如IF、IHC、ELISA、WB）。它含有抗体结合反应增强剂和稳定剂，可以增加抗体的溶解度和稳定性，提高实验的特异性和灵敏度。例如，Genefist GF1600-1通用型抗体稀释液，可以在4°C保存和使用不少于六个月。2 脱脂奶粉：这是一种传统选择，优点是

蓝白斑筛选中，阳性克隆应该是蓝色还是白色？ 蓝色 白色 阳性克隆菌落，应该是白色的。 蓝白斑筛选中菌落会变蓝色，是因为β-半乳糖苷酶将培养基中的X-gal转变为蓝色可溶性物质。 β-半乳糖苷酶怎么来的呢？一部分来自载体具有lacZ基因，一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码α肽链的基因。一部分来自缺陷型大肠杆菌的编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性β-半乳糖苷酶的产生，此现象称为α-互补。 而阳性克隆中

免疫荧光实验原理很简单，其实就是使用荧光二抗，并在荧光显微镜下采集图像，其它的和IHC或ICC区别不大。 但是，想要得到良好的结果却很难，大家经常会遇以下问题： （1）目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果； （2）蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果； （3）DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色； （4）组织切片预处理不当或采用石蜡切片，

一、原理 蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显

在细胞培养的过程中支原体污染是一个让人头疼的问题。它如同一个“不速之客”，悄然潜入细胞培养体系，给我们的实验带来诸多困扰。你是否有过这样的经历，培养的细胞无声无息地就被毁掉了？实验数据很难重复？ 那么，当我们遭遇支原体污染时，该如何应对呢？ 今天，让我们一起来探讨这个困扰。 支原体是一种直径大小仅为0.1-0.3μm，无细胞壁，可轻松透过一般过滤膜混入培养系统中的最小最简单的原核生物，呈高度多形性，有球形、杆形

在大多数的WB实验步骤中，电泳和湿转条件都是经验性的，因为实验试剂的厂家、浓度及实验室习惯等条件影响，网络上诸多经验性的实验方法可能并不适用于所有实验室或者实验人员；尤其是新的课题组或者新手实验人员。可以进行预实验，确定实验步骤的所有时间条件，而预实验中实验条件的确定依赖两种常用的染色方法，即考马斯亮蓝染色（coomassie brilliant blue staining）和丽春红染色（Ponceau S staining）。此外，上述两种染色还能帮助实验纠错，有

qPCR实验中通常会遇到复孔间重复性差的情况，一般有以下两种： 一、CT值很大，如CT≥30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的CT值差异较大。解决方法为如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3 or 5以上，那CT值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的CT值参与计算。 二、CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。可从以下几

qRT-PCR（定量逆转录聚合酶链反应）和Western blot（蛋白质印迹法）是两种常用的生物分子检测技术，它们分别用于检测mRNA和蛋白质的表达水平。虽然蛋白质是由mRNA翻译而来，但mRNA的表达水平总是与蛋白质的表达水平一致吗？做实验任何一个结果如果你验证了几遍都是一样，那么请不要怀疑自己，也许不是你做错了，试图去解释这种现象! 蛋白表达和RNA水平不一致的原因有： 转录后调控：mRNA在转录后可以经历多种调控过程，如剪接、编辑、降解和稳定

1 如何解决？ 均匀悬浮细胞：在进行细胞铺板前，确保细胞悬浮均匀。可以通过轻轻振荡或轻轻旋转培养皿来均匀悬浮细胞，避免细胞聚集或沉积。 使用适当的细胞密度：根据实验的需要，选择适当的细胞密度进行铺板。过高或过低的细胞密度都可能导致不均匀的细胞铺板。可以根据经验或文献中的建议，选择适当的细胞密度；也可以事先预实验摸索，通过接种不同密度的细胞，观察或监测其生长情况来确认合适的接种密度。 均匀分布培养基：在细

qPCR实验中通常会遇到复孔间重复性差的情况，一般有以下两种： 一、CT值很大，如CT≥30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的CT值差异较大。解决方法为如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3 or 5以上，那CT值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的CT值参与计算。 二、CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。可从以下几

普通PCR（聚合酶链反应）仪器在进行实验时可能会出现边缘效应，这通常是指在PCR扩增过程中，靠近管壁或边缘的样本反应可能与中心部分的样本反应有所不同，导致实验结果的不一致性。这种效应可能由多种因素引起，包括温度分布不均、蒸发速率不同等，以下是一些排除边缘效应的方法。 01优化热循环仪的热盖温度 热盖可以帮助减少样本在PCR过程中的蒸发，确保整个PCR管内的温度均匀。确保热盖温度设置得当，通常比样品温度高几度。 02使用热

PCR反应中的主要由引物、 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、Mg2+、模板和Taq DNA聚合酶五个成份组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。 1 引物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： （1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。 （2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引

抗体是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。 1. 做流式的抗体和免疫组化的抗体是一样的吗? 不一定能通用。流式是用直接标记还是间接标记?如果是直接标记的话，那这个抗体一般不是FITC标记或者就是TRITC，PE之类的。如果恰好你的免疫组化，也是想用

巨噬细胞极化是指巨噬细胞在不同微环境刺激下改变其表型的过程。巨噬细胞通常极化为 M1 或 M2 两种表型，分别释放促炎或抗炎因子，发挥不同的功能。M1型巨噬细胞由 Th1细胞因子（TNF-α、IFN-γ）和细菌成分（脂多糖等）诱导，活化的 M1 巨噬细胞吞噬并破坏微生物，清除肿瘤细胞，并将抗原呈现给 T 细胞以引起适应性免疫反应。M2型巨噬细胞由 Th2细胞因子（IL-4、IL-13）诱导，主要发挥抗炎和组织修复的作用，参与伤口愈合、血管生成和纤维化等过程

分子克隆实验——无缝克隆 今天和大家讲讲无缝克隆常见的问题以及解决方法。 1.平板上很少或者没有克隆菌落 建议使用试剂盒附带的阳性对照，可排除试剂盒本身的影响。进一步判定，主要有以下可能的情况和建议： 01载体制备 线性化载体和插入片段的纯度不够，抑制反应。 02插入片段制备 1、引物设计不正确：同源臂15~25nt（不计算酶切位点）,CG含量40~60%。 2、线性化载体和插入片段的纯度不够，抑制反应。若线性化载体与插入片段已经过纯化，

脾细胞是ELISpot和FluoroSpot测定中使用最多的细胞，至少对小鼠和大鼠样本而言是如此。脾细胞可以很容易地从脾脏中分离出来，而不需要Ficoll分离。细胞可以在分离后直接使用，也可以冷冻保存，并在以后批量使用。 下面是编译自https://www.mabtech.com/knowledge-hub/isolation-freezing-and-tha的关于如何最好地（i）分离、（ii）冻存和（iii）复苏脾细胞的详细指南。 脾细胞的分离 材料 细胞过滤器，70µm尼龙，无菌 无菌剪刀和镊子或镊子 无菌培养皿 巴氏移液管，无

无条带 1.蛋白表达量低：充分了解研究的蛋白，表达量低适当增加上样量，20-50μg。 2.本底表达还是诱导表达，非特异性条带。 3.样本提取蛋白使用蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，并设置对照，避免蛋白降解。 4.检查一抗特异性是否适合目的蛋白的种属，看说明书，一抗二抗最好买经过验证的。 5.蛋白转膜效率低：可以丽春红染色检查转膜效率,分子量小的蛋白，注意用小孔茎的膜。 6.适当调整优化转膜的时间和电流。 7.分子量表达低的选择超敏的发光

1. 蛋白类型 确定你的蛋白是什么类型，蛋白类型决定你要使用的表达系统。 胞质蛋白——大肠杆菌系统 分泌蛋白——酵母表达系统（因为大肠杆菌系统缺乏翻译后修饰功能) 膜蛋白——杆状病毒或酵母表达系统 2. 酶切位点 分析目的蛋白DNA序列的酶切位点，使用T4连接酶的方式构建载体时，不要使用目的蛋白DNA序列包含的酶切位点，以防将目的蛋白的DNA序列切断。 3. 稀有密码子 定义：遗传密码子有64种，但是绝大多数生物使用密码子具有偏好性，倾

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA分子。在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。在分子生物学中，质粒 DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。 在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行: 第一步，培养细菌，使质粒扩增; 第二步，进行细菌的收集和裂解; 第三步，质粒 DNA的分离和纯化。 在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比

液氮罐的定义 采用真空绝热保温技术制作的容器，放液氮于其中，利用液氮常压下沸点-196℃的原理，实现生物样本长时间低温保存的设备。 液氮罐的分类 根据液氮罐的不同指标，液氮罐有不同的分类。 按用途分 按用途分，可以分为液氮存储罐和液氮运输罐两种。其中液氮存储罐适合于不同容量长时间的稳定存储，罐体不能用来运输，运输存在安全隐患。液氮运输罐具有体积小和减震结构设计，适用于少量样本的转移存储和短距离运输使用。 按液